Un odor de mare preţ al Bisericii Naşterii Domnului din Betleem este icoana făcătoare de minuni a Maicii Domnului „Betleemița”, aşezată într-un frumos proschinitar, în dreapta scării ce duce în Peştera Naşterii Domnului nostru Iisus Hristos.
Icoana este unică în lume atât pentru că Maica Domnului este reprezentată zâmbind, cât şi pentru faptul că Pruncul său binecuvântează cu mâna credincioşii. Chipul Preasfintei Născătoare de Dumnezeu în această icoană debordează de afecţiune şi linişte, iar zâmbetul de pe faţa ei veseleşte sufletele pelerinilor.
Nu există date precise despre originea icoanei. După tradiţie, icoana a fost zugrăvită de către Sfântul Apostol şi Evanghelist Luca.
Icoana este îmbrăcată într-o ferecătură din aur şi argint deosebit de frumoasă, împodobită cu pietre preţioase, dăruită de ţarina Ecaterina în urma unei minuni pe care a făcut-o Născătoarea de Dumnezeu cu ea. Când a vizitat Ţara Sfântă, ţarina a dăruit veşmintele ei ca să fie „îmbrăcată” Stăpâna lumii întregi. A oferit chiar şi bijuteriile personale, ca să fie aşezate în icoană şi a hotărât ca pe viitor ţarinele să nu mai poarte rubine, încât acest lucru să rămână un privilegiu exclusiv al Maicii Domnului.
De-a lungul timpului, icoana Maicii Domnului din Betleem a fost dusă în procesiuni atât în Ţara Sfântă, cât şi în Grecia şi Rusia.